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biochain Z5030012說明書

更新時間：2020-07-21 點擊次數(shù)：1908

biochain Z5030012說明書

Malachite Green Phosphate Assay Kit

孔雀石綠磷酸鹽檢測試劑盒

總覽

BioChain的孔雀石綠磷酸鹽檢測試劑盒基于對孔雀石綠，鉬酸鹽和游離正磷酸鹽之間形成的綠色絡(luò)合物的定量分析。通過分光光度計（600 – 660 nm）或酶標(biāo)儀可以方便地測量反應(yīng)迅速形成的顏色。非放射性比色測定試劑盒已經(jīng)過優(yōu)化，可提供出色的靈敏度和更長的保存期限。該測定方法簡單，快速，只需一個添加步驟即可測定磷酸鹽?？梢栽谠嚬?，比色皿或多孔板中進行測定?？梢栽?6和384孔板中方便地進行測定，以高通量篩選酶抑制劑。

描述

BioChain的基于細(xì)胞的測定試劑盒可滿足制藥和生物技術(shù)客戶不斷增長的需求，這些需求源于從基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)衍生出來的大量藥物靶標(biāo)。我們的客戶正在尋求在基于細(xì)胞的系統(tǒng)中進行大規(guī)模篩選，因為準(zhǔn)確而完整的細(xì)胞數(shù)據(jù)很有希望并可以代表生物的生理狀況。該試劑盒配有用于該測定的所有試劑的完整系統(tǒng)和易于遵循的方案

孔雀綠磷酸鹽檢測試劑盒 (Z5030012)

孔雀綠磷酸鹽檢測試劑盒是基于對孔雀綠、鉬酸鹽和游離正磷酸鹽之間形成的綠色復(fù)合物進行定量?？稍诜止夤舛扔?(600-660 nm) 或酶標(biāo)儀上方便地測定反應(yīng)快速顯色。對非放射性比色測定試劑盒進行了優(yōu)化，以提供*的靈敏度和延長的有效期。該測定法簡單、快速，涉及磷酸鹽測定的單個加入步驟。可在試管、比色皿或多孔板中執(zhí)行測定。該試驗可方便地在 96 孔和 384 孔板中進行，用于高通量篩選酶抑制劑。

關(guān)鍵特征

試劑非常穩(wěn)定。由于我們的創(chuàng)新配方，不會發(fā)生試劑沉淀。因此，測定前無需過濾試劑，這是其他市售試劑盒的常見要求。

高靈敏度和寬檢測范圍：檢測低至 1.6 pmole 的磷酸鹽，有效范圍為 0.02 M 至 40 M 磷酸鹽。

快速方便：均勻的“混合和測量”測定法可在 20 min 內(nèi)定量測定游離磷酸鹽。

與常規(guī)實驗室和 HTS 格式兼容：可在試管、比色皿或微孔板、分光光度計和酶標(biāo)儀上進行測定。

在 96 孔和 384 孔板中觀察到穩(wěn)健且適用于 HTS：Z' 因子為 0.7-0.9?？稍?HTS 液體處理系統(tǒng)上輕松實現(xiàn)自動化。

應(yīng)用

磷酸酶測定：從肽、蛋白質(zhì)或小分子底物中釋放磷酸鹽。

脂肪酶測定：從磷脂中釋放磷酸鹽

核苷三磷酸酶測定：從核苷三磷酸鹽（ATP、GTP、TTP、CTP 等）中釋放磷酸鹽。

磷脂、蛋白質(zhì)和 DNA 等中磷酸鹽的定量

藥物發(fā)現(xiàn)：高通量篩選磷酸酶抑制劑。

試劑盒內(nèi)容物：在 96 孔板中進行 2,500 次測定

試劑 A：50 mL 試劑 B：1 mL 標(biāo)準(zhǔn)品：1 mL 1 mM 磷酸鹽

儲存條件。試劑和標(biāo)準(zhǔn)品在 4 ℃ 下可穩(wěn)定儲存 1 年。

注意事項：試劑僅供研究使用。使用試劑時，應(yīng)采取實驗室試劑的常規(guī)預(yù)防措施。詳細(xì)信息請參見材料安全數(shù)據(jù)表。

使用 96 孔板的程序

試劑制備。每次測定需要 20 L 工作試劑。通過混合 100 vol 試劑 A 和 1 vol 試劑 B（例如 5 mL 試劑 A 和 50 μL 試劑 B）制備足量的工作試劑。工作試劑在室溫下可穩(wěn)定儲存至少 1 天。

重要提示：使用前必須將試劑恢復(fù)至室溫。每次測定前，重要的是檢查所有酶制劑和測定緩沖液中均不含游離磷酸鹽。向 80µL 樣品溶液中加入 20µL 工作試劑可方便地完成該操作。在 620 nm 處的空白 OD 值應(yīng)低于 0.2，如果 OD 讀數(shù)高于 0.2，檢查磷酸水水平。雙蒸水的 OD 讀數(shù)通常低于 0.1。實驗室清潔劑可能含有高水平的磷酸鹽。*清洗后，確保實驗室器具不污染磷酸鹽。

磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品的制備。通過移取 40 L 1 mM 磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品，置于 960 L 蒸餾水或酶反應(yīng)緩沖液中，制備含 40 M 磷酸鹽的預(yù)混溶液。試管編號。

按下表所示稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。移取 80 L 標(biāo)準(zhǔn)品，一式兩份，置于透明底 96 孔板的孔中。加入僅含水或反應(yīng)緩沖液的空白對照。

No	預(yù)混劑 + H2O	終體積 (mL)	磷酸鹽濃度 (M)	pmoles 磷酸鹽 in 50 mL
1	200mL + 0mL	200	40	2,000
2	160mL + 40mL	200	32	1,600
3	120mL + 80mL	200	24	1,200
4	80mL + 120mL	200	16	800
5	60mL + 140mL	200	12	600
6	40mL + 160mL	200	8	400
7	20mL + 180mL	200	4	200
8	0mL + 200mL	200	0	0

2. 將 80µL 供試品轉(zhuǎn)移至平板的不同孔中。

注：在酶反應(yīng)的情況下，可通過加入特定抑制劑終止反應(yīng)，或通過加入工作試劑直接終止反應(yīng)。試驗前可能需要稀釋反應(yīng)混合物（見一般注意事項）。對于 ATP 酶或 GTP 酶測定，ATP 或 GTP 濃度應(yīng)低于 0.25 mM，如果反應(yīng)混合物含有 > 0.25 mM 的 ATP 或 GTP，則用蒸餾水稀釋樣品。例如，如果 ATP 酶反應(yīng)含有 1 mM ATP，則在反應(yīng)結(jié)束時，在測定前用水將反應(yīng)混合物稀釋 4 倍。

向各孔中加入 20µL 工作試劑。輕敲微孔板輕輕混勻。

4. 室溫下孵育 30 min，顯色。

5. 在酶標(biāo)儀上測定 600 nm-660 nm (620 nm) 處的吸光度。

對于 384 孔板中的測定，程序相同，只是標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的體積應(yīng)為 40 L，工作試劑的體積應(yīng)為 10 L。

圖。96 孔板磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線。孵育 30 min 后，讀取 620 nm 處的 OD。數(shù)據(jù)表示為平均 SD (n = 2)。有效檢測范圍為 0.02-40 M 磷酸鹽。

一般考慮

孵育時間。顯色反應(yīng)在室溫下 30 min 內(nèi)完成。在 30 min 時讀取 OD 值。

在高濃度磷酸鹽 (> 100 M) 或存在高濃度蛋白質(zhì)和金屬（例如）的情況下，可能發(fā)生沉淀。

孔雀綠磷酸鹽檢測試劑盒

如果發(fā)生沉淀，在 H2O 中對樣品進行系列稀釋，運行試驗并測定無沉淀孔的稀釋因子。使用稀釋樣品重復(fù)測定。

酶反應(yīng)緩沖液。由于任何外源性游離磷酸鹽均會干擾試驗，因此確保試驗中使用的蛋白制備液、反應(yīng)緩沖液和實驗室器具不應(yīng)含有游離磷酸鹽非常重要。這可以通過向緩沖液中加入工作試劑并測量顏色形成來方便地檢查。

液體處置。含量測定混合物含 0.4 M 硫酸。建議在處置前用等體積的 1 NNaOH 中和廢液。

數(shù)據(jù)分析

以 OD620 nm 對磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品濃度作圖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測定樣品磷酸鹽濃度。

文獻

Guérette,D. et al (2007)。VI 型中間絲蛋白的分子進化。BMC 進化生物學(xué) 2007,7:164.
Green,M.L. 等人 (2005)。乙二醇誘導(dǎo)大鼠高草酸尿癥，無代謝性酸中毒。Am JPhysiol Renal Physiol 289:F536–F543
Saran,D. 等人 (2006)。RNA 酶催化的多周轉(zhuǎn)硫代-ATP 水解酶和磷酸酶中間體形成活性。核酸研究，34 (11)：3201–3208。
Adkins,M.W. et al (2007)。PHO5 啟動子的染色質(zhì)拆卸對于招募一般轉(zhuǎn)錄機器和共激活因子至關(guān)重要。摩爾細(xì)胞生物學(xué)27:6372–6382.

高通量篩選

Rumsfeld J,Ziegelbauer K,Spaltmann F (2000) .以釀酒酵母和人胞質(zhì)酶為例，對無機焦磷酸酶進行高通量測定。蛋白表達純化18 (3) :303-9.
Cogan EB,Birrell GB,Griffith OH (1999) .基于機器人的無機和有機磷酸鹽自動化檢測。肛門生物化學(xué)271:29-35.
Ng DH,Harder KW,Clark-Lewis I,Jirik F,Johnson P (1995) .測定直接從細(xì)胞中分離的 CD45 蛋白酪氨酸磷酸酶活性的非放射性方法。J Immunol Methods.179 (2) :177-85.
Fisher DK,Higgins TJ (1994) .蛋白磷酸酶的靈敏、高容量比色法。藥學(xué)研究 11 (5) :759-63。

蛋白質(zhì)和 DNA 中的磷酸酶、脂肪酶/磷脂、核苷三磷酸酶和磷酸鹽分析

Harder KW,Owen P,Wong LK,Aebersold R,Clark-Lewis I,Jirik FR (1994) .使用合成磷酸肽對人蛋白酪氨酸磷酸酶 β (HPTPβ) 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域進行表征和動力學(xué)分析。Biochem J. 298 (Pt 2) :395-401.
Queiroz-Claret C,Meunier JC (1993) .聚丙烯酰胺凝膠中磷酸酶的染色技術(shù)。肛門生物化學(xué)209 (2) :228-31.
Geladopoulos TP,Sotiroudis TG,Evangelopoulos AE (1991)?？兹妇G比色法測定蛋白磷酸酶活性。肛門生物化學(xué)192 (1) :112-6.
Samizo K,Ishikawa R,Nakamura A,Kohama K (2001)。通過反相高效液相色譜法測定肌球蛋白 atp 酶活性的高靈敏度方法。肛門生物化學(xué)293:212-5.
Hackney DD,Jiang W (2001) .驅(qū)動蛋白微管刺激的 atp 酶活性的測定。方法 Mol Biol.164:65-71.

岑 X，黃 Y，王 R，陳 Z，吳 Z (1998)?？兹妇G比色法同時測定成骨細(xì)胞大鼠 Ca (2 +)-atp 酶和 Na +、K (+)-atp 酶活性?；w益咳大補血寶。29 (4) :427-30.
Mahuren JD,Coburn SP,Slominski A,Wortsman J (2001)。磷酸鹽的微量測定法提供了使用生理、非顯色底物（如溶血磷脂酸）測定磷酸酶活性的通用方法。肛門生物化學(xué)298 (2) :241-5.
Cala SE (1999) .鈣網(wǎng)蛋白中假定含磷酸鹽肽的測定。生物化學(xué)生物物理學(xué)研究。259 (2) :233-8.
Gibson NJ,Newton CR,Little S (1997)。用于測量聚合酶鏈反應(yīng)中擴增子積累的磷酸鹽比色法。肛門生物化學(xué)254 (1) :18-22.
Ekman P,Jager O (1993) .采用堿水解和孔雀綠定量測定磷蛋白中與絲氨酸和蘇?；鶜埢Y(jié)合的亞納摩爾量的磷酸鹽。肛門生物化學(xué)214:138-41.
Lu X,Pearson A,Lunec J (2003) .MYCN 癌蛋白作為藥物開發(fā)靶點。Cancer Lett.197 (1-2) :125-30.

臨床和一般診斷

Ohyama T,Matsubara C,Takamura K (1996) .靈敏密度測定法測定人淚液中血小板活化因子和其他磷脂。分析員121 (12) :1943-7.
Matsubara C,Ohyama T,Takamura K (1994)。采用硅膠板上的酶反應(yīng)，通過密度測定法定量人唾液中的血小板活化因子和其他磷脂。Yakugaku Zasshi.114 (9) :681-90.
Kirchgesser M,Dahlmann N (1990)。酸性核苷三磷酸酶活性測定的比色法。臨床化學(xué)與生物化學(xué)雜志。28 (6) :407-11.
D'Angelo E,Crutchfield J,Vandiviere M (2001)?？焖佟㈧`敏、微量測定水和土壤中的磷酸鹽。環(huán)境質(zhì)量雜志。30 (6) :2206-2209.

技術(shù)說明

孔雀綠磷酸鹽檢測試劑盒已經(jīng)過優(yōu)化和配制，以提供靈敏、方便和穩(wěn)健的定量測定從酶反應(yīng)和天然來源中釋放的游離磷酸鹽。試劑盒的關(guān)鍵特征如下：